武汉大学实验动物中心
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组织细胞基因组DNA提取

2016-08-18    编辑:    

一、实验原理

真核生物的一切有核细胞(包括培养细胞)都能用来制备基因组 DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内,因此,制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离,又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS(十二烷基硫酸钠)和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质,再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质,得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。

蛋白酶K的重要特性是能在SDSEDTA(乙二胺四乙酸二钠)存在下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中,SDS可破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白与DNA分离,EDTA则抑制细胞中Dnase的活性;而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸,使DNA分子完整地分离出来。

二、仪器及试剂

1. 仪器:

恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度计(GeneQuant)、移液器玻璃匀浆器、离心管(灭菌)、吸头(灭菌)

2. 试剂:

1)细胞裂解缓冲液:

Tris (pH8.0) 100 mmol/L

EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L

NaCL 20 mmol/L

SDS 10%

RNA 20ug/ml

2) 蛋白酶K 称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中,—20℃备用。

3TE缓冲液(pH 8.0):高压灭菌,室温贮存。

4)酚:氯仿:异戊醇(25:24:1

5)异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。

三、操作步骤

1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g0.5cm3),尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中,加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块,转入1.5ml 离心管中,加入蛋白酶K(500ug/ml20μl,混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min,也可转入37℃水浴1224h,间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min,取上清液入另一离心管中。

2.2倍体积异丙醇,倒转混匀后,可以看见丝状物,用100ul 吸头挑出,凉干,用200ul TE 重新溶解。(可进行PCR反应等,需要进一步纯化的按下列步骤进行)

3.加等量的酚:氯仿:异戊醇振荡混匀,离心12000 rpm5min

4.取上层溶液至另一管,加入等体积的氯仿:异戊醇,振荡混匀,离心12000 rpm5min

5. 取上层溶液至另一管,加入1/2体积的7.5mol/L乙酸氨加入2倍体积的无水乙醇,混匀后室温沉淀2min ,离心12000 rpm ,10min

6.小心倒掉上清液,将离心管倒置于吸水纸上,将附于管壁的残余液滴除掉。

7.1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次,离心12000 rpm  5min

8.小心倒掉上清液,将离心管倒置于吸水纸上,将附于管壁的残余液滴除掉,室温干燥。

9.200ul TE重新溶解沉淀物,然后置于4℃或?C20℃保存备用。

10.吸取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。

四、常见问题

1.选择的实验材料要新鲜,处理时间不易过长。

2.在加入细胞裂解缓冲液前,细胞必须均匀分散,以减少DNA团块形成。

3. 提取的DNA不易溶解:不纯,含杂质较多;加溶解液太少使浓度过大。沉淀物太干燥,也将使溶解变得很困难。

4. 电泳检测时DNA成涂布状:操作不慎;污染核酸酶等。

5.分光光度分析DNAA280/A260小于1.8;不纯,含有蛋白质等杂质。在这种情况下,应加入SDS至终浓度为0.5%,并重复步骤28

6./氯仿/异戊醇抽提后,其上清液太黏不易吸取:含高浓度的DNA,可加大抽提前缓冲液的量或减少所取组织的量。