皮下是构建异体移植肿瘤（Cell line-derived xenograft, CDX）模型常用的接种部位。皮下荷瘤实验看似简单，但实际上很多细节都不容忽视，不规范的操作会造成实验过程中不必要的时间和材料的浪费。接下来，和大家分享一些影响皮下荷瘤的因素，供大家参考。

影响因素一.细胞

1.细胞系特性

不同细胞株的成瘤快慢会有差异，建议正式实验之前开展预实验，摸索细胞株成瘤性，同时参考已发文献。

2.细胞状态

细胞培养操作过程要注意防止污染。支原体污染极为常见，会改变培养细胞的代谢、增殖特征及形态等，从而影响肿瘤生长和结果的可重复性。建议接种前对细胞进行支原体检测。

细胞活力是影响肿瘤形成的重要原因，接种细胞建议取处于对数期生长的细胞，接种前对细胞活率进行检测，接种过程中细胞置于冰上，保持低温，接种完成后也可以留一小部分细胞检测细胞活率，确保接种过程中细胞活率没有明显降低。另外，注意避免体外过度传代影响细胞状态（一般3-5代）。

影响因素二.动物

常用的免疫缺陷小鼠品系有：裸鼠、NOD-Scid、NCG等。不同免疫缺陷程度的小鼠或小鼠不同周龄的成瘤速度有所差异，建议根据预实验结果选择合适的动物模型，同时参考已发表的文献。选择小鼠周龄不宜过大，如，裸鼠8周龄以上NK细胞等免疫细胞活力开始增强，一般来说，4～6周龄的裸鼠更容易成瘤，这时免疫系统不够强，成瘤率相对较高。

影响因素三.接种部位

皮下注射主要有4个位点（如下图所示），建议根据细胞株成瘤性和实验目的选择合适的接种部位。一般认为腋下皮下（3号位）血供充足，利于肿瘤细胞增殖，且右侧操作较方便。如果个别瘤种生长速度较快，可以接种后肢或背部等供血量不是特别充足的地方，或者降低细胞接种剂量，减缓肿瘤生长速度。

影响因素四.接种量

不同的细胞系、不同的小鼠和接种位置所需要的细胞剂量会有差异，建议正式实验之前开展预实验，接种量设置多个梯度，摸索出最佳细胞注射剂量。

另外，可以根据细胞株类型选择实验中是否需要添加辅助因子，如matrigel、hormone等。如果成瘤性不好，可尝试在细胞悬液（PBS溶）中添加基质胶（根据说明书比例，一般体积比1：1，冰上操作），提供细胞外基质营养。卵巢癌一般均会加雌激素，接种细胞后单独注射雌激素。

影响因素五.饲养管理

小鼠在运输过程中会产生应激反应，使小鼠出现一系列的病理生理学变化，这些变化会增加某些实验误差，因此在接到动物后应尽量避免立即进行实验，建议让动物有1~2周的适应期。小鼠饲养环境较差会影响小鼠状态，进而影响实验结果，严重时造成小鼠死亡。免疫缺陷小鼠对饲养环境的要求很高，必须饲养在SPF级屏障设施内，且与免疫正常小鼠饲养在不同房间。如果环境设施不达标，有可能会间接影响肿瘤模型的制备：裸鼠长期暴露在弱抗原的刺激下，NK细胞等免疫细胞的活力逐步增强，会导致裸鼠对肿瘤的非特异性免疫力增强；NCG及NCG相关背景品系是重度免疫缺陷模型，对病原体易感，饲养环境清洁消毒不足，会造成环境微生物富集，对这一类小鼠带来健康风险。

荷瘤实验是否成功受很多因素的影响，以上建议仅供参考。另外，个体差异无法避免，肿瘤生长的速度可能不完全同步，实验中建议适当增加小鼠的富余量。